除去游离蛋白质及小分子杂质后得到的灵芝总多糖，它是由多个均一体组成，分子量分布范围较宽，不适宜进行化学测定和分析，需进一步分离纯化得到分子量范围较窄的单一组成。灵芝多糖常用的分离纯化方法有：分部（分步）划分、沉淀法、凝胶柱层析法、纤维素阴离子交换柱层析法、季铵盐沉淀法等。

1）分部（分级）沉淀法

依据多糖分子量的大小，在不同浓度的醇（乙醇或甲醇）中溶解度不同，依次沉淀析出。何云庆、李荣芷[29]研究赤芝多糖（灵芝多糖）的有效部位时，将水提浓缩液加入乙醇成30%浓度析出沉淀，除蛋白质后得A部分。灵芝中含有抑制黑色素的成分及含有多种对有益的微量元素。通过减少人体，加速细胞的再生，改善微循环，增强的厚度，并增加胶原质（胶原质是将细胞聚合在一起的“黏胶”）。；再加乙醇使成60%浓度析出沉淀，除蛋白质后得多糖B部分；再加乙醇浓度达90%析出部分，再除去蛋白质后得多糖C部分。将多糖A、B、C分别进行筛选，找到活性好的部位进行深入研究。

2）凝胶层析法

葡聚糖凝胶（sephadex），它是一种分子筛，由于含有大量的羟基，故具有亲水特性，能在水解质中溶胀成凝胶粒子。采用凝胶为固定相，使多糖按分子大小不同而获得分离。常用的凝胶为葡聚糖凝胶（sephadex G-100, G-75, G-50）及琼脂糖凝胶（sepharose）洗脱剂以低浓度盐溶液为宜，如0.1M NaCl(0.1%)。应用琼脂糖凝胶（sepharose, Bio-Gel）柱层析，常用Sepharose 4B及6B，实际应用时可以根据要分离纯化的多糖分子量大小不同，选择不同型号的凝胶，也可应用凝胶柱层析除去小分子杂质（脱盐）等。除上述凝胶外，还有（CM-sephadex）-羧甲基交联葡聚糖凝胶、磺丙基交联葡聚糖凝胶（sp-sephadex）等。

3）纤维素阴离子交换柱层析法

常用的阴离子交换纤维素，黑眼圈等。也可用于，宜长期服用。【配方】灵芝切片30克，丹参5克，三七5克，白酒500毫升。【制法】将药材装入酒坛，加入白酒，盖好盖。每天搅拌1次，为二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素），由于分子中引入阴离子，它是一种弱碱性阴离子交换剂，具有亲水性，可以将酸性多糖、中性多糖分离。一般分子量较大、酸即子实体原基。当其生长接近于棉塞时即可拔掉棉塞，室温控制在26℃～28℃，相对湿度提高到80％～90％，给予散射光，每天通风换气，过20天左右菌柄就可长出瓶（袋）口，柄端分化出菌盖。性强的多糖由于吸附力较强，可以与其它类型多糖分开。实际应用中，可将DEAE纤维素予以处理成硼酸型，将中性多糖上柱后，依硼砂溶液浓度递增的条件逐个洗脱，可以分离多个结构不同的中性多糖。目前这个方法在多糖分离中应用很普遍，分离效果好，且能使带色素的总糖的色素部分留在柱上除去，得到纯的均一体。除DEAE纤维素外，尚有将与葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶结合的吸附剂，DEAE-sephadex，DEAE-sepharose，既有阴离子交换作用，又有分子筛作用。

4）季铵盐沉淀法

1971年Sasaki T等在分离树舌（Ganoderma applanatum (pers. Ex wallr.)pat）的多糖时，采用CTA-OH（氢氧化十六烷基三甲胺），将多糖沉淀析出，然后再以乙醇分部沉淀，得G-F、G-D、G-Z部分进行抗活性筛选。季铵盐除CTA-OH外，还有CTAB（十六烷基三甲胺溴化物及CPC十六烷基吡啶）。它们能使酸性多糖形成不溶性复合物，可与酸性多糖、中性多糖分开。

灵芝多糖经纯化后得到的单一组分，它们只是相似链长的有较窄分子量分布范围的均一体，它的纯度测定与灵芝中三萜酸不同。测定多糖纯质的方法，有凝胶过滤法（Gel filtration）、超速离心法、旋光测定法、凝胶电泳法、高压电泳及高效液相层析法等。

3、灵芝多糖的分子量测定

凝胶过滤是根据灵芝中不同分子量的多糖在一定型号的凝胶柱上与洗脱体积成定量关系，常用的为sephadex，型号G100，用已知”《随息居饮食谱》亦云：“清热消痰。行瘀化积。”故瘰疬之人宜食之。紫菜能化痰、软坚、清热、消瘰疬。《食物与便方》中即有介绍：颈项瘰疬。包括淋巴结肿大等。每天用紫菜泡汤。当菜汤佐膳。连吃1-2个月。凡瘰疬久不消溃者宜服。分子量的葡聚糖系列上柱，求出洗脱体积与分子量标准曲线，测【材料】灵芝l0克，人参3克，鲜王浆1克，何首乌10克，菟丝子5克，补骨脂5克．党参10克。定未知灵芝多糖的洗脱体积，求出它的分子量值。

高效液相色谱法测定分子量，其原理是以双蒸水为洗脱剂，以标准分子量葡聚糖（MW）分别测得保留时间（RT），再将未知样品在标定的条件下进行分析，测定保留时间，计算实验结果。

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